АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА В/МАССАЧУСЕТС/02/2012
АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА В/МАССАЧУСЕТС/02/2012
Аннотация
В статье представлены результаты картирования вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вируса B/Массачусетс/2/12. Отбор эскейп-мутантов проводили с помощью восьми моноклональных антител, которые были впервые получены к тяжелой субъединице гемагглютинина данного вируса. Наличие вируснейтрализующей активности у моноклональных антител позволило отобрать 16 эскейп-мутантов этого эталонного штамма. Секвенирование гена, кодирующего последовательность гемагглютинина эскейп-мутантов B/Массачусетс/2/12, и сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей с аминокислотной последовательностью гемагглютинина исходного вируса, позволили идентифицировать замены аминокислотных остатков в положениях 136 и 141, 237 и 240, 196 и 202 в петлях – 140, – 240 и в спирале-190, соответственно. Выявлено, что все указанные замены аминокислотных остатков находятся в рецептор-связывающем кармане гемагглютинина вируса гриппа В и оказывают влияние на его антигенную специфичность.
1. Введение
Вирусы гриппа вызывают ежегодные эпидемии глобального масштаба, которые являются причиной роста смертности в мире, представляя собой серьезную проблему для общественного здравоохранения. Большинство научных исследований посвящено главным образом вирусам гриппа А, тогда как знания об антигенной структуре поверхностных и внутренних антигенов вирусов гриппа В по-прежнему достаточно ограничены . Согласно современным данным результатом эволюции вирусов гриппа В стало формирование Ямагатской (В/Ямагата/16/88) и Викторианской (В/Виктория/2/87) эволюционных линий в середине 1980-х годов. В человеческой популяции они социркулируют, по меньшей мере, с 2002 года
, , . Одна треть от общего числа заболеваний гриппом как правило вызваны вирусом гриппа В , который у детей вызывает тяжелые формы . Следует отметить, что показатели госпитализации и смертности, вызванные вирусом гриппа В, ниже, чем для вирусов гриппа A(H3N2), однако выше, чем для вирусов гриппа A (H1N1pdm09) . Инфекции, вызванные этими вирусами клинически практически неразличимы, поражают все возрастные группы, при этом частота осложнений, как правило, выше у детей младшего возраста и пожилых людей , . Диверсификация вирусов гриппа определяется модификациями в геноме, которые включают нуклеотидные замены, делеции и вставки, а также реассортацию, которая для вирусов гриппа В может происходить между и внутри линий , , . Генетические эволюционные характеристики вирусов гриппа В определялись в различных географических регионах , , , , однако широкомасштабная эволюционная динамика вирусов гриппа В на полногеномном уровне исследована слабо , , . Анализ эволюции вирусов гриппа B показал, что она происходит более медленно, в отличие от вирусов гриппа А . Исследования показали, что гены, кодирующие белки полимеразного комплекса (PB1 и PB2) и гемагглютинина (ГА) вирусов обеих линий эволюционируют независимо даже при высоком уровне реассортации, это вероятно определяется геномной несовместимостью данных сегментов , . Отмечается, что вирусы подобные В/Виктория/2/87 подвергаются более быстрому антигенному дрейфу . Высказано предположение, что различия в эволюционной динамике двух линий обусловлены разными предпочтениями связывания гемагглютинина с клеточным рецептором. В/Виктория/2/87 подобные вирусы способны связываться с клеточными рецепторами в позициях -2,3 и -2,6; в то время как В/Ямагата/16/88 подобные вирусы связываются с остатками сиаловой кислоты исключительно в позиции -2,6 в дыхательных путях человека .В связи с вышеизложенным мониторинг изменений антигенной структуры поверхностного белка гемагглютинина вирусов гриппа В, и рецептор-связывающих характеристик вируса остаются актуальными задачами, имеющими как научную, так и важную с практической точки зрения значимость. Использование в современной вирусологии вируснейтрализующих моноклональных антител (моноАТ), которые направлены к конкретным иммуногенным сайтам поверхностного антигена, а также, методологии отбора и изучения эскейп-мутантов (ЭМ), позволяет мониторировать возникновение новых генетических/антигенных модификаций вирусов.
2. Методы и принципы исследования
Вирусы гриппа В получены из коллекции вирусов гриппа и ОРВИ ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.
Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости
Вирусы гриппа культивировали в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов согласно Методическим рекомендациям «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006 г. No 0100/4430-06-34). Для получения аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, 10-11-дневные куриные эмбрионы заражали вирусом гриппа В в дозе от 10 до 100 ЭИД50/0,2 мл, инкубировали 72 часа при температуре 33 ± 0,50 С. Затем эмбрионы охлаждали при температуре +40 С и аллантоисную жидкость, содержащую вирус, собирали и контролировали гемагглютинирующую активность.
Реакция гемагглютинации (РГА), реакция торможение гемагглютинации (РТГА)
РГА и РТГА проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006 г. No 0100/4430-06-34)
. За титр антител принимали наибольшее разведение, при котором полностью подавляется гемагглютинация 4 ГАЕ вируса.Получение гибридом
Гибридомы – продуценты моноАТ к штамму вируса гриппа В/Массачусетс/2/12 Ямагатской линии получали по методу
в следующей модификации. Мышей линии Balb/с иммунизировали внутрибрюшинно 70 мкг очищенного концентрата вируса, который был получен ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Через несколько недель мыши были бустированы очищенным концентратом вируса в дозе 50 мкг/мышь. Через три дня после бустирования проводили слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии X63Ag8.653 в соотношении 10:1 в присутствии 50% раствора полиэтиленгликоля-2000 в среде Игла DMEM («БиоЛот», Россия). Клонирование гибридом проводили методом предельных разведений. Первичное тестирование клонов проводили иммуноферментным анализом. Гибридные клоны с заданным спектром реагирования реклонировали на селективной среде НАТ («Sigma»). Стабильные клоны гибридом – продуцентов специфических моноАТ криоконсервировали, и в дальнейшем применяли для стимуляции образования асцитов.Получение эскейп-мутантов
Для отбора ЭМ, штаммы исходного вируса клонировали в присутствии избытка отобранных моноАТ, обладающих выраженной вируснейтрализующей активностью
. Смесь вирус-моноАТ инкубировали в течение часа при 370 С, после чего инфицировали куриные эмбрионы, через 72 часа отбирали аллантоисную жидкость и анализировали в РГА. Отобранные эскейп-мутанты клонировали 3 раза методом предельных разведений, после чего исследовали их способность реагировать с гомологичными и гетерологичными моноАТ.Секвенирование эскейп-мутантов
Для секвенирования гена НА ЭМ вируса гриппа В/Массачусетс/2/12 РНК выделяли коммерческим набором RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия).
RT-ПЦР. Для амплификации фрагментов гена гемагглютинина применяли набор реагентов AgPath-ID One-step RT-PCR Kit (Ambion, США). Анализ апликонов проводили гель-электрофорезом в 1,7% агарозном геле. Фотосъемка осуществлялась системой мультиплексной визуализации ChemiDoc MP Imaging System (BioRad, США).
Для выделения ДНК ампликонов использовали два метода: набором PCR Purification kit (Quiagen, Германия) или выделяли с помощью DEAE бумаги. Концентрацию ДНК после выделения определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo, США).
Для секвенирования методом Сэнгера применяли коммерческий набор реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). В состав реакционной смеси входили: BigDye Terminator – 1 мкл, 5X Sequencing Buffer – 4 мкл, праймер – 1 мкл, ДНК (из расчета 50 нг ДНК в конечном объеме смеси – 10 мкл) – 5 мкл. Конечный объем смеси – 10 мкл. Для увеличения глубины секвенирования каждая реакция была поставлена в двух повторах. Программа секвенирующей реакции: 96oС – 10 сек, 50oС – 5 сек, 60oС – 4 мин (25 циклов). Реакцию секвенирования проводили в термоциклере BioRad CFX96 Real-Time System C100 Thermal Cycler (BioRad, США). Для определения нуклеотидной последовательности использовали 4-канальную автоматизированную систему капиллярного электрофореза и флуоресцентной детекции ДНК-фрагментов ABI prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для капиллярного электрофореза использовали полимеры ABI prism3130 POP-7.
Сборка, хранение и обработка полученных нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей осуществлялись в программе Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США). Для множественного выравнивания полученных нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями ГА референсного штамма использовали программу Vector NTI 10 Advance и алгоритм CLUSTAL W.
3. Основные результаты
Характеристика моноАТ к вирусу гриппа В/Массачусетс/2/12 в РТГА
РТГА основана на способности антител ингибировать взаимодействие гемагглютинина с эритроцитарными рецепторами. Значимость данной реакции заключается в возможности оценки уровня взаимодействия моноАТ с антигенными сайтами прежде всего в районе «рецепторного кармана» гемагглютинина. «Рецепторный карман» является исключительной мишенью для вируснейтрализующих моноАТ, блокирующих взаимодействие вируса с клеточным рецептором. Рецепторная область представляет собой вариабельную часть молекулы гемагглютинина, претерпевающую наибольшие изменения в процессе эволюции вируса в результате антигенного дрейфа. Благодаря этому вирус ускользает от действия вируснейтрализующих антител. Взаимодействие моноАТ с гемагглютинином отобранных штаммов в РТГА позволяет оценить антигенные штаммовые различия в рецепторной области, что имеет большое и практическое, и теоретическое значение. МоноАТ к штамму В/Массачусетс/2/12 (Ямагата) проявляли выраженную антигемагглютинирующей активностью исключительно к вирусам, относящимся к этой эволюционной ветви (табл. 1).
Таблица 1 - Взаимодействие моноАТ к В/Массачусетс/2/12 с различными штаммами вируса гриппа В в РТГА
Вирусы | Штамм | Титр моноАТ в РТГА | |||||||
1G4 | 1G9 | 2B10 | 3B12 | 3C2 | 4E11 | 5B11 | 5F11 | ||
Вирусы подобные B/Yamagata/16/88
| B/Massachusetts/2/12 (генетическая линия 2) | 1:327680 | 1:655 360 | 1:655 360 | 1:327680 | 1:327680 | 1:20480 | 1:655 360 | 1:655 360 |
B/Yamagata/16/88 | 1:10 240 | 1:81 920 | 1:40 960 | 1:10 240 | 1:20 480 | 1:20 480 | 1:163 840 | 1:20 480 | |
B/Panama/45/90 | 1:163 840 | 1:655 360 | 1:163 840 | 1:20 480 | 1:40 960 | 1:40 960 | 1:81 920 | 1:81 920 | |
B/Harbin/7/94 | 1:163 840 | 1:655 360 | 1:327 680 | 1:163 840 | 1:163 840 | 1:81 920 | 1:327 680 | 1:655 360 | |
B/Yamanashi/168/98 | 1:81 920 | 1:655 360 | 1:327 680 | 1:40 960 | 1:81 920 | 1:81 920 | 1:163 840 | 1:327 680 | |
B/Victoria/504/00 | 1:327 680 | 1:655 360 | 1:81 920 | 1:81 920 | 1:81 920 | 1:40 960 | 1:163 840 | 1:327 680 | |
B/Shanghai/361/02 | 1:5 120 | 1:40 960 | 1:20 480 | 1:20 480 | 1:81 920 | 1:20 480 | 1:81 920 | 1:81 920 | |
B/Florida/07/04 | 1:20 480 | 1:40 960 | 1:20 480 | 1:20 480 | 1:40 960 | 1:20 480 | 1:40 960 | 1:40 960 | |
B/Florida/04/06 (генетическая линия 1) | 1:40 960 | 1:40 960 | 1:40 960 | 1:40 960 | 1:81 920 | 1:20 480 | 1:81 920 | 1:81 920 | |
B/Phuket/3073/13 (генетическая линия 3) | 1:5 120 | 1:40 960 | 1:20 480 | 1:20 480 | 1:40 960 | 1:20 480 | 1:40960 | 1:40 960 | |
Вирусы подобные В/Victoria /2/87 | B /Shandong/7/97 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 |
B /Malaysia/2506/04 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/Brisbane/60/08 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/Brisbane/45/15 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
Штаммы вирусов гриппа В, выделенные до разделения вирусов на эволюционные линии | B/Li/40 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 |
B/Great Lakes/54 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/Russia/69 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/Hong Kong5/72 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/Singapore/222/79 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | |
B/USSR/100/83 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 | 1:80 |
Следует подчеркнуть, что все моноАТ взаимодействовали со штаммами выделенными, начиная с B/Ямагата/16/88, а также со штаммами, относящимися к генетическим группам 1 (B/Флорида/04/06) и 3 (B/Пхукет/3073/13), которые наиболее широко распространены в мире
, . Таким образом, данные РТГА позволяют говорить, что моноАТ, полученные к гемагглютинину штамма В/Массачусетс/2/12, актуальны с точки зрения идентификации новых изолятов. Кроме того, следует отметить, что моноАТ не ассоциировали со штаммами ранних лет выделения, а также со штаммами Викторианской ветви.Отбор ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12 c помощью моноАТ
В результате проведенных исследований подтверждено, что эскейп-мутанты, полученные с помощью вируснейтрализующих моноАТ, стали незаменимым инструментом для мониторинга изменчивости антигенной структуры ГА и поиска иммунодоминантных эпитопов в структуре ГА1. Установлено, что полученные ЭМ содержали до трех мутаций в гене ГА, которые приводили к специфичным аминокислотным заменам. При этом в РТГА с ЭМ наблюдали 8-32-х-кратное и более снижение титров моноАТ, которые использовали для отбора ЭМ по сравнению с исходным вирусом. Таким образом, было получено 16 ЭМ, устойчивых к действию каждого из моноАТ, в частности, было получено по два ЭМ под действием моноАТ 2B10, 3B12, 3C2, 1G4, 1G9 и 4E11, три – моноАТ 5B11 и один – моноАТ 5F11.
Выявление иммунодоминантных эпитопов в молекуле гемагглютинина вируса B/Массачусетс/2/12
Для выявления иммунодоминантных эпитопов было проведено секвенирование ГА ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12. Анализ предсказанной структуры ГА ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12 в сравнении со структурой ГА исходного вируса позволил выявить замены аминокислот в шести положениях. Более того, все замены были расположены в районе рецептор-связывающего сайта (РСС) ГА, и касались петель–140, –240, и спирали–190. Исследование двух ЭМ, для моноАТ 1G9, позволил установить, что ЭМ 1G9/1 содержал две замены, в частности глицина на глютаминовую кислоту в положении 141 (Gly→Glu) и глицина на аргинин в положении 237 (Gly→Arg). Аминокислотная замена глицина на глютаминовую кислоту в 141 положении (Gly→Glu) была выявлена также у ЭМ 2B10/1, 2B10/2, 3C2/1, 3C2/2, 1G4/1, 1G4/2. ЭМ 1G9/2 содержал единственную замену 237 Gly→Arg. Выявлено, что ЭМ 3B12/1, отобранный с помощью моноАТ 3B12, содержал единственную замену пролина на глютамин в 240 положении, а ЭМ 3B12/2 0150 две замены - Pro на Gln в 240 и Asn на Lys в 202 положениях, соответственно. Остаток-240 ГА1, по-видимому является частью антигенного сайта, который частично совпадает с антигенным сайтом D ГA штаммов гриппа А субтипа H3 и антигенным сайтом Ca1 ГA штаммов гриппа А субтипа H1
, . Подобные замены Pro→Gln или Thr в 240 положении ранее были обнаружены среди вирусов гриппа В до их расхождения на две эволюционные ветви , а изменение Pro 240 Ser – у штаммов Викторианской ветви . Подобные замены ранее выявлялись у вирусов ветви Ямагата . В исследовании с использованием моноАТ 5В11 было получено три ЭМ. Две одинаковые замены в 136 и 240 положениях, Arg→Ile и Pro→Ser, соответственно, содержали ЭМ 5B11/1 и 5B11/3, тогда как ЭM 5B11/2 кроме замены Arg→Ile в 136 положении имел также аминокислотную замену Gly→Glu в 141 положении.Следует отметить, что замена-136 имеет важное значение в структуре РСС - остаток Arg в 136 положении обнаружен у 98% вирусов Ямагатской ветви и только у 1% вирусов Викторианской ветви, а штаммы 1972-1982 годов выделения имеют остаток изолейцина
.Рисунок 1 - Расположение аминокислотных замен в молекуле НА1 эскейп-мутантов вируса B/ Массачусетс /2/12
Примечание: А – вид сбоку, Б – вид сверху
На основании представленных данных можно сделать заключение, что идентифицированные в ходе исследования замены вовлечены в формирование ГА вируса B/Массачусетс/2/12 и влияют на способность связываться с моноАТ.
Влияние замен аминокислотных остатков в молекуле ГА ЭМ вирусов гриппа B/Массачусетс/2/12 на характер взаимодействия с моноАТ
Для оценки влияния замен на характер взаимодействия вируса с моноАТ, было изучено их взаимодействие с ЭМ в перекрестной РТГА (табл. 2). Согласно полученным результатам, все ЭМ слабо реагировали с гомологичными моноАТ, с помощью которых они были получены. В этом случае титры моноАТ варьировали от 1/64 в случае моноАТ 1G4 до 1/2048 в случае моноАТ 5F11.
Таблица 2 - Взаимодействие эскейп-мутантов вируса B/Массачусетс/2/12 с моноАТ в РТГА
Эскейп-мутант | АК замена(ы) | Область рецептор-связывающего кармана | Сайт | Титр моноАТ в РТГА | |||||||
1G4 | 1G9 | 2B10 | 3B12 | 3C2 | 4E11 | 5B11 | 5F11 | ||||
G141→E | G141→E G237→R | G141→E | N202→K P240→Q | G141→E | N202→K | R136→I G141→E P240→S | R136→I D196→G
| ||||
1G4/1 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:2560 | 1:1280 | 1:81 920 | 1:640 | 1:2560 | 1:655 360 | 1:327 680 |
1G4/2 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:2560 | 1:1280 | 1:81 920 | 1:640 | 1:5120 | 1:655 360 | 1:327 680 |
1G9/1
| G141→E G237→R | петля 140 петля 240 | BA ---- | 1:10240 | 1:1280 | 1:640 | 1:40960 | 1:640 | 10240 | 1:327 680 | 1:163840-327680 |
1G9/2
| G237→R | петля 240 | ---- | 1:10240 | 1:640-1:1280 | 1:640 | 1:40960 | 1:640 | 1:5120-10240 | 1:163840-327680 | 1:81920-1:163840 |
2B10/1 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:640-1280 | 1:640 | 1:81 920 | 1:320 | 1:5120 | 1:327680 | 1:327680 |
2B10/2 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:640-1280 | 1:640 | 1:163 840 | 1:320 | 1:5120 | 1:327680 | 1:327680 |
3B12/1
| P240→Q | петля 240 | ---- | 1:81 920 | 1:40960- 81 920 | 1:20480-40960 | 1:1280 | 1:2560 | 1:1280 | 1:327680 | 1:640 |
3B12/2
| N202→K P240→Q | α-спираль 190 петля 240 | BB1 ---- | 1:1280 | 1:5120 | 1:2560 | 1:80 | 1:640 | 1:80 | 1:5120 | 1:5120 |
3C2/1 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:2560 | 1:1280 | 1:163840 | 1:640 | 1:5120 | 1:655 360 | 1:655 360 |
3C2/2 | G141→E | петля 140 | BA | 1:5120 | 1:1280 | 1:1280 | 1:163840 | 1:640 | 1:5120 | 1:655 360 | 1:655 360 |
4E11/1
| N202→K | α-спираль 190 | BB1 | 1:5120 | 1:163 840 | 1:81 920 | 1:20 480-40960 | 1:163840 | 1:160 | 1:327 680 | 1:327 680 |
4E11/2 | N202→K | α-спираль 190 | BB1 | 1:5120 | 1:163 840 | 1:81 920 | 1:40960 | 1:163840 | 1:160 | 1:327 680 | 1:327 680 |
5B11/1
| R136→I P240→S | петля 140 петля 240 | BA ---- | 1:163840 | 1:163840 | 1:81 920 | 1:80 | 1:163840 | 1:10240-20480 | 1:320-640 | 1:80 |
5B11/2
| R136→I G141→E | петля 140 петля 140 | BA BA | 1:640 | 1:5120 | 1:2560 | 1:80 | 1:2560 | 1:2560 | 1:10240 | 1:160-1:320 |
5B11/3 | R136→I P240→S | петля 140 петля 240 | BA ---- | 1:163840 | 1:327680 | 1:163840 | 1:80 | 1:327680 | 1:20480 | 1:640 | <1:80 |
5F11 | R136→I D196→G | петля 140 α-спираль 190 | BA BB1 | 1:327680 | 1:655 360 | 1:327680-1:655 360 | 1:80-160 | 1:327680 | 1:20480 | 1:2560 | 1:320 |
B/Массачу сетс/2/12 | -------- | -------- | ------ | 1:327680 | 1:655 360 | 1:655 360 | 1:327680 | 1:327680 | 1:20480 | 1:655 360 | 1:655 360 |
МоноАТ 1G4, 2В10 и 3С2, узнающие эпитоп в 141 положении, показали значительное снижение титров со всеми ЭМ, несущими замену 141Gly→Glu. В тоже время, моноАТ 1G4 также имели заметное снижение титра до 1/32 при взаимодействии с ЭМ 1G9/2, несущим замену Gly→Arg в 237 положении; ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 с заменой Asn→Lys в положении 202 до 1/64 титра; ЭМ 3В12/2, содержащий замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положении до 1/256 титра. Не выявлено существенного снижения титра при взаимодействии с ЭМ 3В12/1 с единичной заменой Pro→Gln в 240 положении (1/4 титра). МоноАТ 1G4 реагировали с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3, содержащими замены Arg 136 Ile и Pro 240 Ser, и с ЭМ 5F11, содержащим замены Arg 136 Ile и Asp 196 Gly, как и с исходным вирусом (1-1/2 тира). Таким образом, установлено, что моноАТ 1G4 распознает эпитопы в положениях 141, 202 и 237.
МоноАТ 2В10 показали снижение взаимодействия до 1/16 титра с ЭМ 3В12/1(замена Pro→Gln в 240 положении) и 1/256 с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys и Pro→Gln в 202 и 240 положениях, соответственно). При этом моноАТ 2В10 взаимодействовали до 1/8 титра с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202 Lys). ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (Arg 136Ile и Pro 240 Ser) реагировали с моноАТ 2В10 до 1/4-1/8 титра. Можно предполагать, что замены в положениях 202 и 240, Asn → Lys и Pro → Gln, соответственно, особенно в совокупности, значимы для связывания с моноАТ 2В10.
МоноАТ 3С2, в отличии от моноАТ 2В10 и моноАТ 1G4, практически не потеряли способности взаимодействовать с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2, содержащими Lys-202, однако, резкое снижение титров наблюдали в реакции с ЭМ 3В12/1, содержащим замену Pro→Gln в 240 положении до 1/128 и ЭМ 3В12/2, содержащим Lys-202 и Gln-240 до 1/512 титра. Изменения Arg 136 Ile в, Pro 240 Ser и Asp 196 Gly не отразились на способности моноАТ взаимодействовать с ЭМ. Можно предположить, что в этом варианте, помимо эпитопа в 141 положении, в случае моноАТ 3С2 существенным моментом является конкретный остаток в 240 положении.
МоноАТ 1G9, распознающие замены в 141 и 237 положениях, слабо реагировали с ЭМ, имеющими замены в 141 и 237 положениях. МоноАТ 1G9 проявляли незначительное уменьшение титров взаимодействуя с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202Lys) до 1/4, до 1/8-1/16 с ЭМ 3В12/1 (Pro 240 Gln) и резкое падение титров с ЭМ 3В12/2 (остаток лизина и глютамина в 202 и 240 положениях). ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (остаток изолейцина и серина в 136 и 240 положениях, соответственно) связывались с моноАТ на 1/2 – 1/4 титра, а ЭМ 5F11 (остаток изолейцина-136 и глицина-196) взаимодействовал с моноАТ 1G9 подобно исходному вирусу.
МоноАТ 3В12 распознавали остатки аспарагина-202 и пролина-240. МоноАТ 3В12 проявляли одинаковый характер реагирования с ЭМ 1G4, 2В10 и 3С2 (Gln →Glu в 141 положении) до 1/2-1/4 титра. МоноАТ 3В12 одинаково взаимодействовали до 1/8 с ЭМ 1G9/2 (Gln →Arg в 237 положении) и ЭМ 1G9/2, имеющим две замены Gln 141 Glu и Gln 237 Arg. Аналогичное взаимодействие было с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202 Lys). При этом, моноАТ 3В12 взаимодействовали до 1/256 с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении) и полностью перестали реагировать с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys и Pro→Gln в 202 и 240 положениях, соответственно). Аналогично, моноАТ 3В12 утратили способность к связыванию с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (замены Arg →Ile и Pro→Ser в 136 и 240 положениях, соответственно), ЭМ 5В11/2 (замены Arg →Ile и Gln →Glu в136 и 141 положениях, соответственно). Также моноАТ 3В12 практически полностью перестали реагировать с ЭМ 5F11 (замены Arg →Ile и Asp→Gly в 136 и 196 положениях, соответственно). Таким образом, вероятно, для моноАТ 3В12 наиболее значимыми являются остатки в 240 и 136 положениях, и в меньшей степени – аминокислотные остатки в 202 положении. Анализ ЭМ 4Е11 установил специфичность моноАТ 4Е11 к эпитопу в 202 положении. Действительно, моноАТ 4Е11 взаимодействовали с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2, содержащими замену Asn→Lys в 202 положении на 1/128 по сравнению с исходным вирусом. Произошла полная утрата способности взаимодействия с ЭМ 3В12/2, содержащим замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях и значительная – до 1/16 титра с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении). Менее значительное снижение титров (на 1/8) произошло в реакции с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly→Glu в 141 положениях). МоноАТ 5В11, по данным секвенирования ЭМ, были специфичны к эпитопам в положениях 136, 240 и 141. Вызывает удивление тот факт, что моноАТ 5В11 взаимодействовали с ЭМ 1G4, 2В10 и 3С2, имеющими замену Gly→Glu в 141 положении, практически, как и с диким вирусом (отличия в РТГА не более 1/2). При этом, моноАТ 5В11 слабо реагировали с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях), но почти до полного титра (на 1/2) с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (замену Asn→Lys в 202 положении) и ЭМ 3В12/1(замена Pro→Gln в 240 положении). Было отмечено существенное снижение титров с гомологичными ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (замены Arg→Ile в 136 и Pro →Ser в 240, положениях) и менее значимое с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly →Glu в 141 положениях). Титр моноАТ 5В11 с ЭМ 5F11 (замены Arg→Ile в 136 и Asp→Gly в 196 положениях) был всего 1/256 от исходного вируса. Незначительное снижение титров на 1/2-1/8 показали моноАТ 5F11 с ЭМ 1G9/1 и 1G9/2, которые содержали, замены Gly→Glu и Gly→Arg в 141 и 237 положениях, соответственно. При этом моноАТ 5F11 слабо реагировали с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении) и ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях). МоноАТ 5F11 очень слабо взаимодействовали с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly→Glu в 141, положениях) и гомологичным ЭМ 5F11 (Arg 136 Ile и Asp 196 Gly), с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (Arg 136 Ile и Pro 240 Ser) взаимодействие отсутствовало полностью. Установлено, что ГА вируса гриппа В содержит четыре основные антигенные области: петли-120, -150 и -160, и спираль-190. Эти антигенные участки лежат в непосредственной близости или частично входят в структуру РСС, располагаясь близко в пространстве, и образуют большой протяженный антигенный сайт [34]. Это согласуется с нашими результатами, в случае, когда одно моноАТ распознает детерминанты, находящиеся в двух различных, но пространственно близких антигенных областях.
4. Обсуждение
Анализ антигенной структуры ГА вирусов гриппа В Ямагатской эволюционной ветви имеет большое теоретическое, и практическое значение. В связи с этим, была поставлена цель провести эпитопное картирование молекулы ГА вирусов гриппа B/Massachusetts/2/12 с помощью моноклональных антител и идентифицировать аминокислотные замены, значимые при связывании с вируснейтрализующими антителами.
Селекция ЭМ вируса гриппа B/Massachusetts/2/12 стала возможной благодаря выраженной вируснейтрализующей активности разработанных моноАТ. Было получено 16 ЭМ, устойчивых к вируснейтрализующему действию каждого из используемых моноАТ, по два ЭМ в случае моноАТ 1G4, 1G9, 2B10, 3B12, 3C2 и 4E11, три ЭМ – моноАТ 5B11 – и один ЭМ – моноАТ 5F11.
В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей ГА ЭМ и ГА исходного вируса установлены замены в шести положениях – 136 и 141 в петле 140, 237 и 240 в петле-240, 196 и 202 в спирале-190.
Оказалось, что большинство замен были расположены в районах, формирующих РСС вирусов гриппа В, а именно в петлях–140 –240 и в спирали–190. Известно, что РСС, находящийся в верхней части молекулы ГА, сформирован спиралью–190 (НА1 193-202) на вершине, петлей–240 (ГА1 237-242) – левая кромка, и петлей–140 (ГА1 136-143) – правый край. При этом четыре аминокислотные остатка в молекуле ГА1 (Phe-95, Trp-158, His-191 и Tyr-202), составляющие основу РСС, высоко консервативны у большинства вирусов гриппа В.
Нами показано, что ряд ЭМ, отобранных с помощью моноАТ 1G4, 2B10 и 3C2, содержали идентичную замену глицина на глютаминовую кислоту (Gly 141 Glu), расположенную в петле–140. В ряде работ было указано, что 141 положение в структуре ГА гриппа В достаточно вариабельно. Так, вирусы с заменой Gly→Val в 141 положении выявлялись еще до расхождения на две филогенетические ветви
, а замена Gly 141 Arg обнаружена у современных вирусов Ямагатской ветви . Кроме того, показано, что некоторые лабораторные варианты вируса гриппа В, такие как, например, выращенные на куриных эмбрионах, проявляли альтернативные антигенные свойства благодаря единичной замене глицина в 141 положении . Было показано, что замена Gly 141 Arg у вируса B/Лион/1271/96 после адаптации к куриным эмбрионам, привела к увеличению сродства к 3′-сиалил(N-ацетиллактозе) и ослаблению связывания с 6′-сиалил(N-ацетиллактозамином). Тогда как вариант того же вируса с Gly в 141 положении, адаптированный к клеткам MDCK, проявлял более высокое сродство с 6′-сиалил(N-ацетиллактозамином) и значительно меньшее сродство к 3′-сиалил(N-ацетиллактозе) . Дополнительно установлено, что содержащий замену Gly→Арг в 141 положении, высокопродуктивный вариант вируса B/Виктория/504/2000 утратил способность связывать гликаны с 2,6 гликозидной связью. Тогда как, исходный вирус B/ Виктория /504/2000 предпочтительно связывался с гликанами с 2,6 гликозидной связью, но имел низкое сродство к гликанам с 2,3 гликозидной связью .Анализ двух ЭМ, полученных с использованием моноАТ 1G9, показал, что ЭМ 1G9/1 имел две аминокислотные замены глицина на глютаминовую кислоту (Gly → Glu) в 141 позиции и глицина на аргинин (Gly → Арг) в 237 позиции. ЭМ 1G9/2 содержал только замену Gly → Арг в 237 позиции. Примечательно, что обе замены располагаются РСК ГА, но при этом, находятся в двух различных районах - замена Gly → Glu в 141 позиции в петле-140, в тоже время, замена Gly → Арг в 237 позиции - в петле-240. Установлено, что присутствие остатка Gly-237 делает петлю-240 более протяженной, а единичная замена в донном положении обеспечивает переориентацию боковых цепей. Изменение ориентации боковых цепей в последовательности 235-240 ГА1 может кардинально изменять антигенные свойства этого региона (33 Ni F., et al., 2013). Так как, пространственно остатки Gly-237 и Gly-141 находятся близко, по-видимому, замена Gly→Arg в 237 позиции изменяет пространственную структуру таким образом, что это позволяет моноАТ 1G9 распознавать эпитоп в положении 141 ЭМ 1G9/1, имеющего замены Gly 141 Glu и Gly 237 Arg.
Установлено, что ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 содержали единичную замену Asn 202 Lys. Ранее было обнаружено, что большая часть остатков, окружающих РСК ГА вируса гриппа В, одинаковы у штаммов Ямагатской и Викторианской ветвей, кроме нескольких положений: 163, 198, 202 и 203 (нумерация для вирусов гриппа Викторианской ветви); в случае наличия Asn – 163 потенциального сайта N-гликозилирования в ГА вирусов гриппа В Ямагатской ветви нет
. Более того, отрицательно заряженный аминокислотный остаток Glu в 198, нейтральный остаток Ala в 202 и положительно заряженный остаток Lys в 203 позициях у вирусов Викторианской ветви, находящиеся в спирали 190, замещены у вирусов Ямагатской ветви соответственно на остатки Lys в 197, Lys в 201 и Asn в 202 позициях. Рассматривается, что эти три остатка могут играть существенную роль в специфичности распознавания сиалированных цепей . Установлено, что замена Asn 202 Lys повлияла на рецептор-связывающие свойства ГA вируса гриппа B/Флорида/04/06 Ямагатской ветви, вероятно, увеличив рецепторный репертуар. Таким образом, замена аспарагина в 202 позиции может влиять как на антигенные, так и на рецепторные свойства ГА. Замены в 148, 149, 150 и 203, позициях, прилегающих к сайту связывания рецептора ГА, определяли основные антигенные различия между ранними В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 подобными вирусами .Показано, что ЭМ 3B12/1 имел единичную замену пролина на глютамин в 240 положении, а ЭМ 3B12/2 содержал две замены Pro 240 Gln и Asn 202 Lys. Ранее замена Pro 240 Ser была обнаружена у ЭМ Викторианской ветви . Рядом авторов рассматривается вариант, что переориентация боковых цепей в петле 240 влияет на изменение антигенных характеристик этого региона
, . Из 8 вариантов ЭМ (V1–V8) вируса В/Осака/983/97 Викторианской ветви, которые были селектированы с помощью моноАТ 10В8, ЭМ V3 и V8 (замена лизина на треонин в 203 положении), утратили способность контактировать с гетерологичным моноАТ 8Е6. Тогда как ЭМ V1 и V2 (замена пролина на серин в 241 положении), отобранные под действием моноАТ 8Е6, реагировали с гетерологичным моноАТ 10В8. Авторы полагают, что остаток в положении 203 входит в структуру или находится вблизи эпитопа моноАТ 8Е6. Установлено, что остатки пролина в 240 и серина в 242 позициях, находятся в эквивалентных положениях к остаткам 226 и 228, соответственно, в ГA штаммов гриппа А субтипа H3. Эти оба остатка вовлечены в качестве основных детерминант рецепторной специфичности . ЭМ 5B11/1 и 5B11/3 имели две одинаковые аминокислотные замены Arg 136 Ile и Pro 240 Ser, в то время как ЭM 5B11/2 имел аналогичную аминокислотную замену Arg→Ile в 136 и аминокислотную замену Gly→Glu в 141 положениях. ЭМ 5F11 имел две аминокислотные замены Arg→Ile и Pro→Gln в 136 и 196 положениях. Ранее было показано, что левый край рецептор-связывающего сайта ГA B/Гонконг/8/73 содержит аминокислотные остатки Pro в 238 и Ser в 240 положениях, находящихся в эквивалентных позициях остаткам 226 и 228, соответственно, в молекуле ГA штаммов гриппа А субтипа H3. Хотя боковая цепочка в случае остатка Pro в 238 позиции короче, чем в случае аминокислотного остатка Leu в 226 позиции в молекуле ГA штаммов вирусов гриппа А субтипа H3, главные цепочки петли-240 в ГА B/ Гонконг /8/73 сдвинуты в сторону петли-140 так, что боковые цепочки атомов, ответственные за взаимодействие с рецепторами, были расположены аналогичным образом . Вероятно, замена остатка Pro в положении 238, придающего жесткую структуру петле-240, на Ser, меняет конформацию молекулы таким образом, что позволяет распознавать антителам остатки в петле-120. С другой стороны, можно предположить, что замены на изолейцин в 136 и серин в 240 положениях являются компенсаторными. Большая часть остатков петли-190 вариабельны. Прежде были описаны ЭМ с единичной заменой в позиции 196, конкретно, аспарагина на аспарагиновую кислоту или лизин, которая приводит к потере потенциального сайта N–гликозилирования , , а также вариантам, адаптированным к росту в куриных эмбрионах . Замена остатка Asp → Gly в 196 позиции не приводила к появлению потенциального сайта N–гликозилирования. Тогда как единичная замена остатка Asp → Tyr в 194 положении у вирусов гриппа В, приспособленных к росту в куриных эмбрионах, значительно меняла антигенные свойства, что свидетельствует об антигенной значимости спирали-190, независимо от прикрепленных к ней гликанов . Спираль-190 гемагглютинина вируса гриппа В частично совпадает с антигенным сайтом D ГA вируса гриппа А субтипа H3 и сайтом Ca1 ГА вируса гриппа А субтипа H1 , . Несомненно, все остатки в структурее спирали-190 играют важную роль в антигенных свойствах ГА вируса гриппа В .Все остатки на наружной поверхности спирали–190 имеют значимую антигенную роль. Отдельные замены в этой области неоднократно встречались в ЭМ вирусов гриппа, селектированных с использованием моноАТ: Glu 195 Lys, Gln 197 Lys, Val → Ala, Leu или Glu в 199 пзициих
, , Lys 200 Asn, Arg или Thr , , и Ser → Leu или Pro в 205 положении , . Кроме того, исследование ГA вируса гриппа B/Гонконг/73 с использованием сайт-направленного мутагенеза показало, что замены Thr → Pro в 196 и Gln → Ile в 197 позициях полностью подавляют способность моноАТ взаимодействовать с исследуемым вирусом . «Горячей точкой» на спирали–190 является последовательность аминокислотных остатков 194-196 ГA1, представляющая собой потенциальный сайт N-гликозилирования. Вирус с единичной заменой Ala → Thr в 196 положении, которая создает новый потенциальный сайт гликозилирования в последовательности 194-196 ГA1, вызвал эпидемию в Японии . Кроме того, единственная замена остатка Asn → Ser в 194 положении, вызвала различия в антигенной реактивности между двумя циркулирующими B/Ямагата/16/88 подобными штаммами . Таким образом, полученные данные подтверждают ранее полученные результаты о том, что вариабельность остатков в структуре спирали-190 сильно влияет на антигенные свойства гемагглютинина вируса гриппа В .5. Заключение
В результате проведенных исследований с помощью разработанных моноАТ, обладающих вируснейтрализующей активностью, получены 16 ЭМ эталонного штамма B/Массачусетс/2/12, резистентных к этим моноАТ. Сравнительный анализ предсказанных последовательностей ГА ЭМ B/Массачусетс/2/12 и исходного вируса позволил выявить в ГА1 вируса гриппа В Ямагатской ветви замены в 136 и 141 (петля-140), 196 и 202 (спираль-190) и 237, 240 (петля-240) положениях. Все выявленные аминокислотные замены расположены в участках, которые участвуют в формировании РСК ГА вируса гриппа В и оказывают влияние на антигенную специфичность ГА.